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实验操作

1. TRAzol的使用量情况如下。

样品量

10 cm2的贴壁培养细胞

107的悬浮培养细胞

100 μl的白细胞

50～100 mg的普通组织样品

50～100 mg的特殊组织样品（肝、脾、骨及软骨等）

15～30 mg的植物材料（多糖和多酚含量不高的）

2. 实验样品的研磨和匀浆。

A. 贴壁培养细胞

① 倒出培养液，用1×PBS清洗一次。

② 每10 cm2生长的培养细胞中加入1 ml的TRAzol，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。

③ 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

④ 室温静置5分钟。

B. 悬浮培养细胞

① 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心2分钟，弃上清。

② 向每107个细胞中加入l～2 ml的TRIzol。

③ 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

④ 室温静置5分钟。

C. 动物组织、植物材料样品

① 将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。

② 对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的TRAzol，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。

   对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的TRAzol的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。

③ 将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。

④ 12,000 g 4℃离心5分钟。

⑤ 小心吸取上清液，移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。

3. Total RNA的提取。

① 向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿(TRAzol的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用力振荡(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状(无分相现象)后，再室温静置5分钟。

② 12,000 g 4℃离心15分钟。

③ 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。

④ 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。

⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。

4. RNA沉淀的清洗。

   小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。

5. RNA的溶解。

   室温干燥沉淀2～5分钟(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明)，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

　注意事项：

  ● RNA样本保存液如出现沉淀，37℃加热振荡混匀。

  ● 加入RNA样本保存液后，样本不能立即置于-20℃或-80℃，要先4℃置放过夜，待组织充分浸润后再置于低温保存。

  ● 样品浸没在RNA样本保存液中，可在37℃保存1天，25℃保存1周，4℃保存1个月，-20℃长期保存；使用时请注意保存时限。

  ● 保存在RNA样本保存液中的样本可不经特殊处理，离心或直接使用和新鲜组织一样的RNA提取方法提取RNA。

  ● RNA样本保存液可以配合各种常见的RNA提取试剂盒使用，如东盛、invitrogen、omega等公司出品的RNA提取试剂盒，不影响试剂盒操作，不影响提取所得RNA质量及其后续实验。