12-HETE Elisa Kit原理：

ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

12-HETE Elisa Kit 组成：

自备材料

1）蒸馏水。

2）加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3）振荡器及磁力搅拌器等。

12-HETE Elisa Kit 标本要求

1.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2.不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2.操作步骤

1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2 孔、阳性对照2 孔、空白对照 1

孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照 50µl。然后在待测样品孔先加样品稀释液 40µl，然后再加待测样品 10µl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3.温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

4.配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。

7.温育：操作同 3。

8.洗涤：操作同 5。

9.显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 分钟.

10.终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。

12-HETE Elisa Kit 数据计算

1. 绘制标准曲线：各标准品 OD 值减去底色即减去空白孔 OD 值，以 6 个标准

品的 OD 值为纵坐标 y，以标准品的浓度为横坐标 x，绘制曲线图，如图示，

并计算出回归方程 y=ax+b。

2. 将待测样品的 OD 值代入方程式，计算各组样品浓度，再乘以稀释倍数，即

为样品的实际 ABP 浓度。

3. 敏感度：1.0 pg/ml

注意事项：

1. 实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。

2. 加样：加样时，要控制加样速度，避免**孔与最后一孔间的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响

实验的准确性以及重复性。

3. 孵育：严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。

4. 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化，如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。

5. 建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。

6. 建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系，

如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。

12-HETE Elisa Kit安全性

1． 避免人体直接接触显色剂A、B和终止液。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2． 实验中不要进食、抽烟或使用化妆品。

3． 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

保存条件及有效期：

1.试剂盒保存：2-8℃

2.有效期：6个月