裸鼠甲种胎儿球蛋白/甲胎蛋白(AFP)elisa试剂盒说明书

                          裸鼠甲种胎儿球蛋白/甲胎蛋白(AFP)elisa试剂盒说明书

检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人钙卫蛋白（Calprotectin）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人钙卫蛋白（Calprotectin）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

1.   血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.   血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.   细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.   组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.   保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1.     酶标仪（450nm）

2.     高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒温箱

操作注意事项

1.   试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.   实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.   标准品稀释液即可视为阴性对照或者空白；预处理后的样本无需稀释，直接取10μL加样即可。

4.   严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.   所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

名称96孔配置48孔配置备注

微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无

标准品（120μg/g）0.6mL0.6mL按说明书进行稀释

标准品稀释液6mL3mL无

样本稀释液6mL3mL无

检测抗体-HRP10mL5mL无

20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释

底物A6mL3mL无

底物B6mL3mL无

终止液6mL3mL无

封板膜2张2张无

说明书1份1份无

自封袋1个1个无

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：120、60、30、15、7.5、3.75 μg/g

试剂的准备

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.   手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2.   自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1.   从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.   设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.   待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4.   随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.   弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.   每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.   每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能

1.   准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2.   灵敏度：最低检测浓度小于1.0μg/g。

3.   特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.   重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

5.   贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.   有效期：6个月

免责声明

1.   试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2.   严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。